近年来随着免疫治疗和靶向治疗等新型肿瘤疗法的不断发展，肿瘤的临床诊疗取得了很多突破性进展，但肿瘤转移仍然是肿瘤致死的主要原因之一。现有的临床诊断方法在预测转移性肿瘤上仍然存在很多局限性，主要包括：诊断阈值不足、与时间和空间肿瘤异质性相关的采样偏差较大以及对转移性病变的获取方式有限等等，这也是改善肿瘤患者预后的主要障碍。
血液来源的肿瘤材料为早期诊断、预后和预测抗肿瘤药物反应提供了一种实用且微创的方法。血液样本中主要的分析物是循环肿瘤细胞(CTC)，它从肿瘤的原发部位脱落到血液中，最终在远端定植实现肿瘤转移。作为肿瘤转移的先驱，CTC不仅为捕获最具侵略性的肿瘤克隆提供了机会，也提供了肿瘤经血液传播转移的生物检测指标。然而，CTC的罕见性为科学研究和临床诊断带来了巨大挑战，导致CTC在肿瘤转移诊断和靶向治疗的临床应用进展缓慢。如何将CTC作为肿瘤转移和治疗的预测工具推进CTC使用，是当下转移性肿瘤诊疗中面临的关键问题。
近日，瑞士苏黎世联邦理工学院分子健康科学研究所的Nicola Aceto教授团队在肿瘤领域的顶级期刊《nature reviews cancer》上发表题为“Biology, vulnerabilities and clinical applications of circulating tumour cells” 的综述（图1），对血液中循环肿瘤细胞(CTC)研究领域的最新发展进行了全面概述，重点总结了CTC在血源性转移中的作用，描述了影响CTC转移潜力的各种因素，回顾了当前最新的CTC检测、捕获和下游分析技术，为CTC的临床转化研究提供了指导。
图1 （图片来源：Nature reviews cancer）
转移性肿瘤的扩散模式
大多数肿瘤转移是通过肿瘤细胞直接进入血管或淋巴系统引起的，较少的转移是通过肿瘤细胞直接扩散到邻近组织发生的。虽然目前使用阳性淋巴结状态作为晚期肿瘤的标志，但也有实验证据表明，经淋巴系统转移的肿瘤细胞必须在转移之前穿过淋巴系统才能实现远端转移。因此与淋巴转移相比，血源途径才是肿瘤转移的主要途径。
肿瘤的经典转移模型
经过几十年来的科学研究，原发肿瘤形成的详细病理机制已基本清楚，但转移性肿瘤的生物学基础仍没有被充分阐明。转移是一个多步骤的过程，取决于原发肿瘤中具有侵袭和转移能力的细胞克隆，这些细胞克隆通常会通过静脉逃逸，以CTC的形式进入血液，并在远处组织或器官定植，生长成继发性肿瘤。
肿瘤细胞的经典转移模型主要包括两种：(1)线性或晚期传播模型；(2)平行进展或早期传播模型。第一种假设是：随着时间推移和自然选择，在原发肿瘤内产生最适合转移的肿瘤细胞克隆，随后这些优势细胞从原发部位脱落经血液实现转移，这会引起转移瘤和原发瘤表现出高度的遗传相似性。然而事实上，转移瘤和原发瘤却存在很大的遗传差异，这也表明肿瘤细胞逃逸可能发生在肿瘤进化的早期，甚至可能发生在肿瘤前阶段，这些脱落的细胞在转移的过程中不断突变进化，这就是肿瘤转移的第二种经典模型。
如果应用系统发育学原理来研究肿瘤转移-扩散行为，会发现肿瘤的转移方式远比上述的经典转移模型复杂得多。对肿瘤谱系分支和进化过程中出现的独特亚克隆细胞分析发现，肿瘤转移灶之间存在单克隆或多克隆种子，这说明转移过程是极其复杂的。肿瘤细胞的扩散可能不仅通过单克隆细胞发挥作用，还能通过发挥核心作用的多克隆肿瘤细胞同时转移实现，最终导致转移后的肿瘤在空间和时间上都远离原发肿瘤。
转移性扩散的第一个关键步骤是肿瘤细胞侵袭，通过静脉进入近端血管(图2)。这种侵袭可通过被动脱落或主动入侵进入血液循环系统。在被动脱落的情况下，肿瘤流体力学和未成熟的肿瘤新生血管屏障功能降低都有助于将肿瘤细胞排出到外周。然而，肿瘤细胞被动脱落的频率和确切条件仍然知之甚少。
图2 癌症转移级联的逐步进展（图片来源：Nature reviews cancer）
CTC表型异质性和CTC聚类
上皮细胞在与周围环境失去联系时通常会经历“失巢凋亡”；那么，如果肿瘤细胞也遵循这样的规则，原则上是无法实现转移的，但事实上肿瘤不仅可以实现转移，还能在靶器官定植。那么究竟哪些特性能支持CTC成功转移呢？EMT被认为是转移的关键条件，它既增加了CTC非接触生存期(即对失巢凋亡的抵抗力)，也增加了CTC潜在的侵袭性。临床前研究表明，EMT转录因子，如SNAIL和TWIST，在体外抑制细胞-细胞接触，增加运动性和侵袭性。但是，在基于EMT谱系追踪的模型中发现，EMT也能阻止转移性肿瘤细胞的定植。通过对以上现象进行观察分析发现，EMT在肿瘤转移中的作用不是二元的，而是过渡性的，EMT是肿瘤转移的影响者而不是驱动者。因此，在CTC中EMT处于中等水平，并与可塑性、干细胞样特征、不良治疗反应和疾病进展相关。
对细胞接触依赖、集体迁移和高度转移的CTC群集观察发现，转移肿瘤的多克隆和亚克隆之间存在互利或协同作用，肿瘤的扩散不仅通过单个CTC发生，也通过异构CTC集群发生。一些研究表明，CTC集群，包括外周循环中总CTC集群，与单个CTC相比，转移潜力增加了100倍。同型聚类增强了各种细胞特性，不仅能上调转移抑制基因的甲基化还能引起转录因子OCT4、SOX2和NANOG结合位点甲基化，共同促进CTC 转移和定植(图3A)。
图3 循环肿瘤细胞簇的生物学特征（图片来源：Nature reviews cancer）
聚类不仅会发生在同型CTC之间，也发生在CTC与其他细胞 (异型簇)之间，包括血小板、髓系细胞和CAFs (图3B)。CTC与血小板的相互作用在血液循环中迅速发生，不仅能提升CTC的转移能力，还能提供免疫保护，使CTC免受T细胞和NK细胞的清除。中性粒细胞是形成异型CTC簇的另一个帮凶。中性粒细胞被CXCL5和CXCL7依赖的趋化作用募集，并通过血管细胞粘附分子1 (VCAM1)介导的粘附与CTC建立细胞接触，增加其增殖和转移潜力 (图3B)。此外，CTC还能诱导中性粒细胞外陷阱形成，促进粘连和CTC细胞外渗。中性粒细胞也能保护CTC免受免疫监视。CTC与髓源性抑制细胞和巨噬细胞聚类也有类似作用。除了具有重要的生物学意义之外，聚类形状还会影响循环中的CTC行为，表型的可塑性和聚类的变异都能影响CTC转移能力。
CTC的检测与分析
由于CTC的稀有性，捕获CTC仍然具有挑战性，高效的CTC富集对于可重复的下游分析和应用至关重要。
CTC检测和分析方法可分为抗原依赖性和抗原非依赖性方法（图4）。迄今为止，最广泛使用的方法使用CTC上表达的抗原和循环中其他细胞上最低表达的抗原来实现阳性选择。FDA批准的CellSearch系统和AdnaTest CTC Select都使用基于EpCAM表达的免疫磁性选择。进一步的标记物，包括pan-CK和CD45，分别用于提高敏感性和特异性。磁性活化细胞分离（MACS）技术将抗体包被的磁珠用于CTC捕获。
不基于抗原的检测技术利用物理特性，如大小、电荷、密度或弹性来富集CTC。正在开发多模态方法，以进一步提高灵敏度和特异性。例如，Isoflux结合了流量控制和免疫磁珠，而Cyttel系统是一种基于图像的检测工具，它顺序结合离心、免疫组织化学和荧光原位杂交来识别CTCs。微流体平台Parsortix和CTC iChip还可以与基于标记物的阳性和阴性选择（例如EpCAM、EGFR、HER2和CD45）、成像和显微操作相结合，以分离纯CTC亚组。
图4 循环肿瘤细胞捕获、分析（图片来源：Nature reviews cancer）
基于CTC的临床应用
CTC的脆弱性和针对性：目前消除转移的策略与应用于原发性肿瘤的策略相同：靶向生长和肿瘤发生，而不是转移过程本身。几种临床前研究和未来临床试验设计的想法正在挑战这种真正转移靶向药物。因为转移性癌症是CTC的后代，靶向CTC原则上会直接中断转移进程（图5）。
靶向CTC的策略有以下几种：
1. 使用血管正常化诱导剂靶向缺氧诱导的CTC簇释放，防止CTC渗入/渗出血管；
2. 抑制或破坏CTC簇的药物比如尿激酶，Na+/K+-ATP酶抑制剂等，通过破坏血小板/中性粒细胞与CTC的相互作用，降低转移潜能；
3. 免疫检查点抑制剂可以标记CTC被T细胞杀死；
4. 通过基于时间疗法的设计优化当前可用的治疗机会，以在CTC生产高峰期间实现最大效果。
这些方法为未来研究中针对CTC提供了令人兴奋的机会；然而，考虑到转移过程的复杂性，它们在临床环境中的实施和临床价值的证明将需要高度创新和雄心勃勃的试验设计。
图5 循环肿瘤细胞靶向策略（图片来源：Nature reviews cancer）
CTC的预后和预测价值：人们对CTC作为精确肿瘤学生物标志物的兴趣越来越大。在所有主要癌症的外周血中都检测到了CTC，并且在乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌以及小细胞和非小细胞肺癌中已经证明了CTC的预后价值，治疗前CTC计数升高可预测无病和总生存期缩短。重要的是，几项研究表明，与基线CTC状态相比，治疗后CTC数量的变化提供了更好的预后信息，治疗后持续存在的CTC会导致更差的预后。除了单个CTC计数外，CTC簇丰度的评估显著提高了接受治疗患者的预后价值。
CTC计数在疾病临床表现前7–9周可检测到，这表明患者的CTC分析有助于预测最小残留疾病和疾病晚期复发，并为早期癌症检测提供工具。CTC的真正威力在于其代表高转移性肿瘤亚克隆的潜力及其作为分子和功能研究最新生物标志物来源的丰富性。
总结
近年来，快速的技术进步使得能够从患者的血液样本中识别和检测罕见的循环肿瘤细胞（CTC），从而开辟了新的研究领域，并为基于液体活检的临床应用带来了希望。CTC的分析揭示了不同的生物学表型，包括CTC簇的存在以及CTC与免疫或基质细胞之间的相互作用，影响转移形成，并为癌症脆弱性提供了新的见解。在这里，研究团队回顾了在理解CTC生物学特征方面取得的进展，并为利用这些发展来设计未来的临床工具以改进癌症的诊断和治疗提供了见解。
转移仍然是改善癌症患者预后的一个巨大障碍。对肿瘤细胞在远处植入肿瘤能力的生物学过程的深入理解正在开始实现，部分原因是对CTC作为血液传播转移前体的严格研究。对CTC簇的早期观察和对其生物学特性的最新解剖突出了其复杂性，但也暴露了脆弱性，因此也暴露了有针对性的机会。要实现CTC的全部潜力，需要从单纯的计数和预测向高度控制的分子表征发展，以开发精确的预测生物标志物。技术和创新可能为加强对罕见但珍贵的CTC种群的检测铺平道路，从而克服目前的诊断和治疗局限性。
文章来源：Being科学、小桔灯网